為何需要進行菌種鑑定？
- 微生物污染來源的確認
- 產品添加菌的品質檢驗
- 標準菌株品管
微生物污染來源的：
食品、藥品、化粧品、飲用水、醫藥器材、生物製劑等與人體生理安全相關之產品，進入各大銷售通路前，需確保產品為無菌或含菌量低於相關法規標準值。產品若遭受微生物污染，導致品質腐敗，增加消費者的安全風險，則除了產品經濟價值的損失外，更會影響消費者的信心，對公司品牌也會受損。
因此，在產品生產過程中如何降低微生物汙染尤為重要，各生產環節中均可能發生微生物汙染，如：原物料、機械設備、操作人員、生產與儲存空間等，若能即時鑑定汙染菌種，並提出有效預防汙染的計畫，便能降低損失。
產品添加菌的品質檢驗：
近年來，由於益生菌的臨床效果逐漸被證實，市面上出現許多食品、醫藥、保健食品等產品皆標榜其中添加多種益生菌，然而部份產品經過抽驗後，發現實際上菌種、菌數含量與標示不符合之情況，雖不至於讓消費者處在安全風險之中，但產品與公司形象都會因此受損，要避免這樣的問題，可以先進行產品自我把關，確認自身產品中益生菌實際保有活性之菌種菌量，並委託第三方公正機構進行指定菌種檢驗，不僅提升消費者的信心，亦能建立良好的品牌形象。
標準菌株品管：
此外，菌種鑑定亦能應用於實驗、研究所使用之標準菌株，進行實驗前預先確認標準菌株正確無誤，避免菌株因污染或保存失當，使實驗失敗導致經濟損失與實驗結果可信度降低。
菌種鑑定之方法
菌種鑑定依檢體類型各有其適合的處理方法，前處理後所分離之菌落依菌落型態與染色鏡檢結果初步分類為細菌、酵母菌與絲狀真菌，並選擇適當之鑑定方式，實驗室目前主要使用之鑑定方法為 MALDI-TOF MS 鑑定分析，並視情況使用生化套組或分子生物法定序輔助分析，詳如表 1 及表 2 。
基質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀 (MALDI-TOF MS)：
Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass-Spectrometry
為一種新興的菌種鑑定技術，鑑定原理為全細胞蛋白質質譜指紋分析，並與 MALDI Biotyper 資料庫中已知菌種的全蛋白質譜訊號做比對，快速鑑定未知菌種的身份，該鑑定方法具有多項優點，台美特別斥資導入並應用於菌種鑑定服務：
- 單一的新鮮菌落即可進行分析，且每一樣品盤最多可上 94 個樣品點，具高通量分析鑑定的效果。
- 內建為微生物資料庫含超過 5,000 多筆菌株標準質譜可供比對，並可自行擴建質譜指紋比對資料庫。
- 已獲得台灣 TFDA 及歐盟、美國 FDA 之體外醫療檢測 (IVD) 驗證。
- 在食品工業方法研究所生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center，BCRC) 及國際知名菌種中心（如美國 ATCC、德國 DSM、 日本 NBRC、荷蘭 CBS 等）廣泛使用於微生物品管、分類鑑定和大量菌株之快速篩選。
- 比對分析後所獲得的結果前一、二名若為相同菌種學名，且皆大於一定分數 (2.0) 則可認定為該未知菌種之身份。
MALDI-TOF MS 固然便利，但仍有諸多菌種，如：絲狀真菌或尚未建立標準菌株質譜指紋的細菌，無法經由該鑑定方法確認其菌種所屬，亦無法鑑別全蛋白質質譜相似之菌種，如：Bacillus cereus group，因此分子生物法定序或生化試驗的輔助仍不可或缺。
分子生物方法：
抽取未知菌種的 DNA，經聚合酶連鎖反應儀器增幅後定序，將獲得的核酸序列與 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 資料庫進行比對分析，以鑑定菌種身份。亦可使用特定菌株之專一性引子探針進行 Real-time PCR 檢驗個別菌株，確認產品內是否存有指定菌株。
生化特性試驗：
依照微生物生長代謝需求與產物的不同來確認菌種的身份，如：不同碳氮源的利用、是否具有溶血特性、芽孢生成生否或特定酵素有無等等特性。依細菌細胞壁染色特性與型態的差別可分成革蘭氏陽性桿菌、球菌與陰性桿菌、球菌等類別，在生化試驗項目的選擇上也不同，如：革蘭氏陽性球菌的觸酶與凝固酶測試、陰性桿菌的 IMViC 或生化八管。
除了傳統的生化試驗外，市面上亦有能快速進行生化試驗的鑑定套組，本公司所使用之快速套組 有 API 20E、API 50 CHB、API 50 CHL 與 Remel RapID™ 快速生化鑑定。
API 20E 鑑定套組含 20 小管，可進行 23 種生化試驗，適用於腸道桿菌或其他革蘭氏陰性桿菌之鑑定；API 50 CHB 與 CHL 則含有 49 種不同碳水化合物，分別用來快速鑑定芽孢桿菌屬與乳酸菌；Remel RapID™ 為目前最完備之生化鑑定套組之一，可鑑定多達 400 多種微生物。不同於傳統生化試驗的繁雜測項選取與操作，快速的生化鑑定套組能夠在相對較短的時間內完成生化試驗，加快菌種鑑定的效率。
表一、不同檢體類型之鑑定方法選用
| 項目 | 檢體類型 | 鑑定方法 | 備註 |
|---|---|---|---|
| 未知菌種鑑定 | 1. 平板培養基 2. 污染樣品 3. 添加菌株之完整產品 | 1. 生化試驗 2. MALDI-TOF MS 3. PCR增幅定序 | 1. 一般環境菌種鑑定 2. 污染源鑑定 3. 針對產品中未指定菌株，以MALDI-TOF MS滿盤方式檢測 |
| 指定菌株鑑定 | 1. 添加菌株之完整產品 2. 複合性乳酸菌產品 | 1. 生化試驗 2. MALDI-TOF MS 3. PCR增幅定序 4. Real-Time PCR | 1. 產品中指定菌株鑑定 2. 複合性乳酸菌產品以Real-time PCR菌株專一性引子進行個別鑑定 |
表二、常見菌種鑑定方法比較
| 鑑定方法 | 細菌分離培養 | MALDI-TOF MS | 分子生物法鑑定 |
|---|---|---|---|
| 適用菌種 | 細菌、酵母菌 | 細菌、酵母菌 | 細菌、真菌 |
| 鑑定流程 | 增殖培養 ↓ 分離純化 ↓ 生化試驗 | 增殖培養 ↓ 分離純化 ↓ 蛋白質萃取鑑定 | 核酸萃取與增幅 (PCR) ↓ 定序確認菌種 或 菌株專一性引子探針 （個別鑑定） |
| 儀器與試劑 | 培養基、生化試管、 快速鑑定套組 | MALDI-TOF MS | 核酸萃取套組 聚合酶連鎖反應儀器 |
| 工作天數 | 5-10天 | 2-3天 | 5-7天＊ |
| 備註 | 檢體需含有活菌 | 檢體需含有活菌 | 無活性菌株 亦可進行鑑定 |
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