Real-time PCR食品檢測

談即時聚合酶鏈反應 Real-time PCR 檢驗技術

Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR

隨著 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 的發現，以聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 為基礎，分子生物技術在短短幾十年間出現飛躍性的成長，從各物種 DNA 序列解密、身份親緣的鑑定、基因轉殖技術應用，乃至分子醫學的應用，各領域皆蓬勃發展。

聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 試驗技術，就是利用 DNA 聚合酶對對特定 DNA 序列大量的合成，進行專一性的連鎖複製反應，可將目標的 DNA 序列片段數量放大為原來的一百億至一千億倍。

 

PCR 執行四大要素

執行試驗時，需齊備四大要素：

1. 欲複製 DNA 的原始模板 (Template)
2. 界定複製範圍兩端的引子 (Primers)
3. DNA 聚合酶 (Taq polymerase)
4. DNA 合成的原料及緩衝液

 

PCR 擴增反應主要四個步驟

1. DNA 變性 (Denaturation)：利用高溫使 DNA 模板變性打開
2. 引子黏接 (Annealing of primers)：讓引子藉由專一性與目標 DNA 片段進行結合
3. 引子延展 (Extension of primers)：DNA 聚合酶開始複製目標 DNA 片段
4. 重複步驟：依序重複執行前三步驟，製作更多的目標 DNA 片段

 

Real-time PCR 食品檢測的好幫手

應用在食品原料鑑定、食品成分攙偽、素食真假判別、過敏原料分析等測項

即時聚合酶鏈鎖反應 (Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)，是藉由 PCR 擴增原理將目標 DNA 放大，同時進行即時定量之試驗技術。這項技術因為能鑑定目標物種的特異性基因片段，能精準地鑑別出食品是否含有動物、植物、雞豬牛羊等特定成分，所以食品藥物管理署將其列為食品攙偽的公告檢驗方法。

早期檢驗含動物性原料食品時，多以物種特定的蛋白質做為檢測標的，但往往因加工過程蛋白質變性，無法順利分析蛋白質做出有效的鑑定。DNA 分子具有穩定且不易降解的優點，有利於作為偵測標的，因此 Real-time PCR 的出現，可以有效對於特定物種的標的基因進行增幅確認，藉此對特定目標進行成分鑑定，這個技術可利用在食品原料鑑定、食品成分攙偽、素食真假判別、過敏原料分析等應用範圍。

 

Real-time PCR 與 PCR 的不同

即時聚合酶鏈反應 (Real-time PCR) 方法的最大特色是即時，過往傳統的 PCR 檢測方法在 DNA 聚合連鎖反應後，需經過電泳、染膠、呈色等步驟，才能觀察目標 DNA 片段的有無並進行定量，工程既耗時又費力，而 Real-time PCR 則是大大簡化了繁複的試驗步驟，藉由引子帶入螢光物質的設計，使 DNA 複製過程中可即時觀察到螢光訊號的變化，快速判讀目標 DNA 片段的有無與含量多寡，達到確認檢體中是否含有特定成分的目的。

• 非探針型 DNA binding dye system

非探針型系統的原理，是因為螢光物質嵌入雙股 DNA 時會散發螢光，隨著 PCR 進行，雙股 DNA 含量累積上升，進而造成螢光訊號累增，此類螢光偵測系統為非專一性，以 SYBR Green 系統為代表，在操作時須小心 primer dimer 或非專一性產物的產生，可能造成實驗誤判。

• 探針型 Probe system

探針型系統的基本原理，是設計具專一性的核酸探針，其上黏接螢光散發物質，這些螢光物質可因距離散發不同波長的光線，如 FRET (Fluorescence resonance energy transfer) 系統，藉由 DNA 聚合酶將探針水解產生螢光訊號，進而偵測其 DNA 複製的情形。

Real-time PCR 使用限制、試驗因應方式

即時聚合酶鏈反應 (Real-time PCR) 雖然方便，但必須配合適當的檢體與正確的標的基因，才能有效發揮鑑別功能，達成食品檢測的目的。

舉例來說，試驗檢體必須能夠萃取出足量的 DNA 模板 (Template)，才能執行 DNA 的複製增幅，在公告方法中便要求最低檢測濃度必須達 0.1%（以乾重計）。若為高度加工的食品，如：長時間熬煮的牛奶糖產品、經強酸強鹼處理的變性食品、經萃取分離的保健食品原料，皆可能因為溫度、酸鹼破壞、萃取分離，造成 DNA 破碎不完整或根本不含有 DNA 模板。另外也可能因為檢體的成分配方，使萃取出的檢體 DNA 檢液含有對 PCR 反應具抑制性之成分，造成試驗結果的不精確，為了因應這種狀況，試驗執行時必須同時測試正各種對照試驗，確保試驗結果正確無誤。

而標的基因的引子選定也是非常重要的，以「食品中動物性成分檢驗方法－定性篩選檢驗」為例，動物類成分篩選檢驗可以選用 16S ribosomal RNA 或 12S ribosomal RNA 的基因引子，但若檢測目的是為了分辨食品中是否含蛋成分，則建議使用動物 12S ribosomal RNA 的基因引子。

Real-time PCR 檢驗技術雖然靈敏度高、檢驗結果判別依據明確等優點，但因為有試驗目的與檢體適用性等限制，對於產品合格與否仍須搭配產品製程確認、原料配方使用以及現場實際查核結果，做出綜合性判斷，才能下定產品合格與否之結論。

 

Real-time PCR 的品質管控，如何提高試驗準確度?

為了確保 Real-time PCR 執行時的可信度，台美檢驗藉由各種品質管制手段確保試劑品質與試驗準確性，避免各種影響試驗執行之可能因素。

平時實驗室需定期執行試劑品質管理，包括：引子、探針皆須進行品質確認，不定期抽檢確認品質，始能進行試驗操作；利用足量的陽性對照物質/標準物質 (positive control) 進行品質試驗，確認 Real time PCR 之 CT 值達到允收標準，作為引子與探針降解與否之參考。

每次執行試驗時，除了檢體之試驗組外，還需搭配陽性對照組、陰性對照組及空白對照組，確認試驗執行之有效性。而檢體 DNA 之增幅產物螢光分析圖須與陽性對照組螢光分析圖進行相互比對，當檢體 DNA 與陽性對照組之 PCR 螢光分析圖皆出現經由探針所產生之螢光增幅曲線，即確認該 Real-time PCR 增幅產物為測試項目之基因片段，因此確認檢體中含有該目標檢測成分。

示意圖：以 Lightcycler 實施 Real-time PCR 即時檢測畫面

為確認檢體 DNA 檢液是否具有干擾性，可能抑制 PCR 反應的進行，每次試驗必須同時執行干擾試驗組 (EC)，以檢體加上陽性對照物質/標準物質，判斷試驗的執行是否有效克服檢體基質對於即時 PCR 方法的干擾抑制現象。

而試驗結果如果有難以判定的情形發生，應再重複執行試驗，並加做稀釋之檢體測試，重新確認試驗的正確與否。

 

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