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解讀公告的腸桿菌科計數方法

衛福部公告的腸桿菌科檢驗方法流程圖

 

衛福部食藥署公告的食品中腸桿菌科計數檢驗流程示意圖

 

解讀公告的腸桿菌科計數
(Enumeration of Enterobacteriaceae) 方法

VRBGA 的檢測原理

 VRBGA(結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂,紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂)的組成分中含有乳糖(雙糖)及葡萄糖(單糖),微生物通常先利用葡萄糖作為碳素源,耗盡後才將乳糖分解為葡萄糖。此外,蛋白腖及酵母抽出液則作為氮素源、微量元素及生長因子的來源,膽鹽 (bile salt No. 3)可使細胞膜滲漏,因此可抑制腸道菌的大多數菌,主要是革蘭氏陽性菌(不能抑制葡萄球菌、鏈球菌及腸球菌以及一些芽孢桿菌)和部分的革蘭氏陰性菌(不包括腸內菌)。VRBGA 與分離大腸桿菌的 VRBA(結晶紫中性紅膽鹽瓊脂)組成分稍有不同,後者不含有葡萄糖,僅含有乳糖,且瓊脂的濃度為15~18 g/L(前者為 10~12 g/L)。VRBA 適用於乳糖發酵性大腸桿菌群的分離,而 VRBGA 適合所有腸桿菌科菌種的分離,分離的菌種類別涵蓋較廣。

衛福部公告的腸桿菌科檢驗方法建議利用葡萄糖氧化發酵試驗 (O/F Glucose fermentation test) 進行腸桿菌科初步生化試驗主要是區分葡萄糖發酵性(如腸內菌)及非發酵性革蘭氏陰性桿菌(如假單胞菌),所用的培養基為 O/F Glucose medium,加入的瓊脂(洋菜)為 3.5 g/ L 蒸餾水。因此,屬於半固體培養基,雖然配方沒有什麼特別,但培養基原料可影響測試菌的生化反應結果,因此要慎選廠牌,編著者多年的經驗以 BD-Difco 之粉末培養基可獲得正確的結果。原料中酪蛋白酵素水解物 (enzymatic digest of casein) 及葡萄糖 (glucose) 可提供碳素源、氮素源、微量元素及生長因子,磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 可提供酸鹼緩衝環境,氯化鈉 (sodium chloride) 可維持滲透壓,至於溴瑞香草酚藍 (bromothymol blue) 作為 pH 變化的指示劑,在酸性環境 (pH 6.0) 呈黃色,鹼性 (pH 7.6) 呈深藍色。因為葡萄糖氧化發酵試驗 (O/F Glucose test) 係測定測試菌的還原葡萄糖能力,因此,接種後要加入無菌的礦物,以維持無氧狀態。

腸桿菌科的菌種特性為能夠利用葡萄糖產酸,使用的測試培養基為葡萄糖氧化發酵試驗 (O/F Glucose fermentation test),不能用 TSA + 葡萄糖 + 酚紅 (phenol red) 或溴甲酚紫 (bromcresol purple) 指示劑,也不能用 TSB + 葡萄糖 + 酚紅或溴甲酚紫指示劑做為測試培養基,如欲進行詳細菌種的鑑定,可利用 API-20E 或 RapID onE 套組,也可用自動化鑑定套組或 MALDI-TOF MS 系統。然而,衛福部公告的方法稱如使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或生化鑑定系統,其檢驗結果有爭議時,以公告的檢驗方法為準。

氧化酶試驗主要用於區分腸桿菌科菌種(氧化酶陰性)與氧化酶陽性之革蘭氏陰性非腸道菌如產氣單胞菌 (Aeromonas),鄰志賀單胞菌 (Plesiomonas shigelloides)、弧菌 (Vibrio species)、假單胞菌 (Pseudomonas)等。氧化酶反應係根據細菌的細胞色素 (cytochrome) 氧化酶系統利用分子氧活化還原型的細胞色素,然後作為電子傳送系統最終步驟的電子接受者 (electron acceptor)﹝即氫氣接受者 (hydrogen acceptor)﹞,再根據菌種及酵素系統的不同,從氫氣產生水或過氧化氫 (hydrogen peroxide)。氧化酶催化氫氣從基質移除,但僅利用氧氣作為氫氣的接受者。

由於氧化酶試劑容易因空氣而快速氧化,有效期為 1 天,因此必須於試驗當天新鮮配製。Oxidase(氧化酶)試劑製配製方法:配 1% tetramethyl-para-phenylenediamine dihydrochloride 溶液,以 0.1 g 試劑溶於 10 mL 純水,或用一支木棒挑取少許試劑粉末(約0.1 g)與  10 mL 純水混合。配製後須放置 15 分鐘後才能使用。

 

食品微生物檢驗技術

以上摘自 「食品微生物檢驗技術」第 11 章「腸桿菌科 (Enterobacteriaceae) 之檢驗」第三節,本章節共有七小節:

第一節 前言
第二節 公告的食品中腸桿菌科檢驗方法
第三節 解讀公告的腸桿菌科計數方法
第四節 公告的食品及水中腸桿菌科指標菌檢驗的採樣計畫及限量標準
第五節 中國大陸之腸桿菌科計數檢驗的國標方法
第六節 腸桿菌科平板計數法檢驗結果計算的範例
第七節 比較台灣衛福部公告及中國大陸國標腸桿菌科的計數方法

蔡文城 博士 (台美檢驗 創辦人暨實驗室負責人)、蔡岳廷 博士 (台美檢驗 總經理)編著
九州圖書文物有限公司 出版  ISBN:978-986-6929-47-2

 

 

 

台美檢驗微生物檢驗專家

台美檢驗以學術專業起家,在微生物檢驗上,具有最紮實的技術和豐富實績,自 2001 年創立後,已成為全台唯一橫跨醫學、化學及生物相關領域的第三方公正檢驗機構。

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