解讀公告的腸桿菌科計數方法、VRBGA 的檢測原理-台美檢驗

308 月 2018 by superlab.tw

衛福部公告的腸桿菌科檢驗方法流程圖

衛福部食藥署公告的食品中腸桿菌科計數檢驗流程示意圖

解讀公告的腸桿菌科計數
(Enumeration of Enterobacteriaceae) 方法

VRBGA 的檢測原理

VRBGA（結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂）的組成分中含有乳糖（雙糖）及葡萄糖（單糖），微生物通常先利用葡萄糖作為碳素源，耗盡後才將乳糖分解為葡萄糖。此外，蛋白腖及酵母抽出液則作為氮素源、微量元素及生長因子的來源，膽鹽 (bile salt No. 3)可使細胞膜滲漏，因此可抑制腸道菌的大多數菌，主要是革蘭氏陽性菌（不能抑制葡萄球菌、鏈球菌及腸球菌以及一些芽孢桿菌）和部分的革蘭氏陰性菌（不包括腸內菌）。VRBGA 與分離大腸桿菌的 VRBA（結晶紫中性紅膽鹽瓊脂）組成分稍有不同，後者不含有葡萄糖，僅含有乳糖，且瓊脂的濃度為15~18 g/L（前者為 10~12 g/L）。VRBA 適用於乳糖發酵性大腸桿菌群的分離，而 VRBGA 適合所有腸桿菌科菌種的分離，分離的菌種類別涵蓋較廣。

衛福部公告的腸桿菌科檢驗方法建議利用葡萄糖氧化發酵試驗 (O/F Glucose fermentation test) 進行腸桿菌科初步生化試驗主要是區分葡萄糖發酵性（如腸內菌）及非發酵性革蘭氏陰性桿菌（如假單胞菌），所用的培養基為 O/F Glucose medium，加入的瓊脂（洋菜）為 3.5 g/ L 蒸餾水。因此，屬於半固體培養基，雖然配方沒有什麼特別，但培養基原料可影響測試菌的生化反應結果，因此要慎選廠牌，編著者多年的經驗以 BD-Difco 之粉末培養基可獲得正確的結果。原料中酪蛋白酵素水解物 (enzymatic digest of casein) 及葡萄糖 (glucose) 可提供碳素源、氮素源、微量元素及生長因子，磷酸氫二鉀 (K₂HPO₄) 可提供酸鹼緩衝環境，氯化鈉 (sodium chloride) 可維持滲透壓，至於溴瑞香草酚藍 (bromothymol blue) 作為 pH 變化的指示劑，在酸性環境 (pH 6.0) 呈黃色，鹼性 (pH 7.6) 呈深藍色。因為葡萄糖氧化發酵試驗 (O/F Glucose test) 係測定測試菌的還原葡萄糖能力，因此，接種後要加入無菌的礦物，以維持無氧狀態。

腸桿菌科的菌種特性為能夠利用葡萄糖產酸，使用的測試培養基為葡萄糖氧化發酵試驗 (O/F Glucose fermentation test)，不能用 TSA + 葡萄糖 + 酚紅 (phenol red) 或溴甲酚紫 (bromcresol purple) 指示劑，也不能用 TSB + 葡萄糖 + 酚紅或溴甲酚紫指示劑做為測試培養基，如欲進行詳細菌種的鑑定，可利用 API-20E 或 RapID onE 套組，也可用自動化鑑定套組或 MALDI-TOF MS 系統。然而，衛福部公告的方法稱如使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或生化鑑定系統，其檢驗結果有爭議時，以公告的檢驗方法為準。

氧化酶試驗主要用於區分腸桿菌科菌種（氧化酶陰性）與氧化酶陽性之革蘭氏陰性非腸道菌如產氣單胞菌 (Aeromonas)，鄰志賀單胞菌 (Plesiomonas shigelloides)、弧菌 (Vibrio species)、假單胞菌 (Pseudomonas)等。氧化酶反應係根據細菌的細胞色素 (cytochrome) 氧化酶系統利用分子氧活化還原型的細胞色素，然後作為電子傳送系統最終步驟的電子接受者 (electron acceptor)﹝即氫氣接受者 (hydrogen acceptor)﹞，再根據菌種及酵素系統的不同，從氫氣產生水或過氧化氫 (hydrogen peroxide)。氧化酶催化氫氣從基質移除，但僅利用氧氣作為氫氣的接受者。

由於氧化酶試劑容易因空氣而快速氧化，有效期為 1 天，因此必須於試驗當天新鮮配製。Oxidase（氧化酶）試劑製配製方法：配 1% tetramethyl-para-phenylenediamine dihydrochloride 溶液，以 0.1 g 試劑溶於 10 mL 純水，或用一支木棒挑取少許試劑粉末（約0.1 g）與 10 mL 純水混合。配製後須放置 15 分鐘後才能使用。